El italiano, nueve veces campeón mundial, cronometró una vuelta de un minuto y 43,954 segundos en el Doble Óvalo de Motegi, con lo que concluyó 0,180 segundos delante del español Marc Márquez de Honda.
Jorge Lorenzo de Yamaha, compatriota de Márquez, entró tercero, seguido por el italiano Andrea Dovisiozo con una Ducati.
Márquez lleva una ventaja de 52 puntos sobre Rossi en la tabla general y podría quedarse con el título de 2016 si gana el domingo.
El británico Cal Crutchlow de Honda y el español Aleix Espargaró, encima de una Suzuki, quedaron en quinto y sexto sitio respectivamente, ubicándose en la segunda fila de la parrilla de salida para la carrera del domingo.